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1 免疫學(xué)檢測(cè)

　　免疫學(xué)檢測(cè)依據(jù)免疫學(xué)理論和技術(shù)，基于抗原抗體反應(yīng)，從而設(shè)計(jì)抗原、抗體、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子的檢測(cè)分析方法。微生物表面具有其特異的抗原，并能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體；通過(guò)抗體結(jié)合表面抗原位點(diǎn)反應(yīng)前后的信號(hào)變化，檢測(cè)目標(biāo)物；其中，借助標(biāo)記物進(jìn)行間接檢測(cè)的研究，得到了快速的發(fā)展和檢測(cè)效果的改善。近年來(lái)，發(fā)展較快的免疫檢測(cè)方法有如下四類。

　　1.1 酶聯(lián)免疫吸附法

　　酶聯(lián)免疫吸附分析法的關(guān)鍵點(diǎn)是酶標(biāo)記，利用標(biāo)記酶對(duì)底物的催化性能，將信號(hào)進(jìn)行放大，從而達(dá)到靈敏檢測(cè)致病菌的目的。在檢測(cè)時(shí)，常借助抗原抗體間的特異性，通過(guò)三明治夾心結(jié)構(gòu)將酶引入體系，此時(shí)載體上的酶量與待測(cè)菌的量呈現(xiàn)一定的比例。加入酶的催化底物，酶與底物反應(yīng)后所形成產(chǎn)物的量與待測(cè)菌的量呈現(xiàn)一定的關(guān)系，因此只要檢測(cè)出產(chǎn)物的量就可以定性或定量檢測(cè)致病菌。由于酶有較高的催化效率，間接放大了免疫檢測(cè)信號(hào)，該類檢測(cè)方法具有較高的靈敏度。

　　1.2 熒光免疫檢測(cè)法

　　1941年，Coons等將熒光素用作標(biāo)記構(gòu)建檢測(cè)體系。經(jīng)過(guò)發(fā)展，該類方法的標(biāo)記物拓展到其它熒光活性分子，標(biāo)記對(duì)象主要為抗原、抗體，在免疫反應(yīng)結(jié)合后，通過(guò)熒光成像、熒光光度計(jì)等檢測(cè)標(biāo)記物的熒光信號(hào)，間接表示目標(biāo)物含量。該類方法在可視化檢測(cè)領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。

　　1.3 免疫膠體金標(biāo)記分析法

　　免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)主要包括膠體金光鏡染色法、斑點(diǎn)金免疫滲濾法和膠體金免疫層析法。它是一種將膠體金標(biāo)記技術(shù)、層析分析技術(shù)以及免疫檢測(cè)相結(jié)合的快速檢測(cè)技術(shù)。c# 圖像識(shí)別其原理是依靠抗原與抗體的特異性結(jié)合，zui終使膠體金變色，從而達(dá)到定性或定量檢測(cè)目的。在檢測(cè)時(shí)，將抗原滴至加樣孔膜上與金標(biāo)抗體結(jié)合，在吸水材料的牽引下沿試條展開(kāi)，到達(dá)檢測(cè)線時(shí)由于特異性結(jié)合形成兩個(gè)抗體結(jié)合一個(gè)抗原的復(fù)合物，由于金顆粒的沉淀，因此檢測(cè)線呈紅色。未結(jié)合抗原的抗體行至對(duì)照線，與上邊的抗體結(jié)合，使得對(duì)照的線呈現(xiàn)紅色，出現(xiàn)兩條紅線。若不含有目標(biāo)致病菌則不發(fā)生結(jié)合，檢測(cè)線不變紅色，zui終只出現(xiàn)一條紅線。

　　1.4 免疫磁珠技術(shù)

　　免疫磁珠分離技術(shù)將磁性分離與免疫反應(yīng)相結(jié)合，從而構(gòu)建免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)；首先在磁珠上包被抗體，再與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合，將目標(biāo)菌進(jìn)行識(shí)別分離，zui后磁力富集。該類方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、反應(yīng)時(shí)間短。如果將免疫磁珠分離技術(shù)與快速檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，可以將致病菌檢測(cè)時(shí)間由傳統(tǒng)的幾天縮短到幾小時(shí)，因此，在食源性致病菌檢測(cè)中，免疫磁珠技術(shù)具有廣闊的發(fā)展空間。

　　2 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

　　核酸生物分子作為生命體的基本單元，負(fù)責(zé)遺傳信息的編碼、傳輸及表達(dá)，作用非常重要。它由核苷酸組成，根據(jù)化學(xué)組成不同分為核糖核酸（簡(jiǎn)稱RNA）和脫氧核糖核酸（簡(jiǎn)稱DNA）。目前已有的核酸擴(kuò)增技術(shù)分為兩大類：靶核酸的直接擴(kuò)增與信號(hào)放大擴(kuò)增。靶核酸直接擴(kuò)增包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、鏈替代擴(kuò)增、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和核酸依賴擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增和滾動(dòng)環(huán)擴(kuò)增；另一類是信號(hào)放大擴(kuò)增：包括支鏈DNA、侵染探針和滾動(dòng)環(huán)擴(kuò)增等。分子生物學(xué)方法在致病菌檢測(cè)領(lǐng)域，得到了很好的應(yīng)用[7]。

　　2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

　　1985年，Mullis等人發(fā)明了PCR技術(shù)，相對(duì)而言，PCR技術(shù)具有特異性高、靈敏度好、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。PCR是一種DNA體外復(fù)制技術(shù)，通過(guò)復(fù)制放大，擴(kuò)增目標(biāo)互補(bǔ)DNA片段，以微量的DNA為起點(diǎn)，獲得大量的復(fù)制DNA。PCR的基本原理和DNA復(fù)制過(guò)程相似，其特異性依賴于靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。一般分為三個(gè)階段：加熱模板DNA發(fā)生變性；冷卻使模板DNA與引物互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；在適度的溫度下進(jìn)行引物的延伸。重復(fù)這三個(gè)過(guò)程能獲得更多半保留復(fù)制鏈，從而能在短時(shí)間內(nèi)將目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍，PCR技術(shù)主要應(yīng)用于單管PCR產(chǎn)物的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。

　　2.2 連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LCR）

　　1987年，Backman研究發(fā)明了LCR方法技術(shù)。1991年，Backman和Barany分別用耐熱DNA連接酶延伸了LCR試驗(yàn)，為L(zhǎng)CR的實(shí)用發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。LCR技術(shù)依靠堿基的互補(bǔ)配對(duì)原理開(kāi)展檢測(cè)，在DNA連接酶的作用下，通過(guò)連接與模板DNA互補(bǔ)的兩個(gè)相鄰寡核苷酸鏈，進(jìn)行DNA片段的快速擴(kuò)增，從而復(fù)制出大量靶基因。

　　2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）

　　2000年，Notomi等提出LAMP技術(shù)，LAMP技術(shù)依靠能對(duì)靶序列上的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域特異性識(shí)別的4種引物，及具有鏈置換活性的DNA聚合酶，通過(guò)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，達(dá)到靶序列的擴(kuò)增。反應(yīng)包括兩個(gè)階段，循環(huán)擴(kuò)增始發(fā)物的形成與循環(huán)延伸。首先，由外部引物擴(kuò)增出內(nèi)部引物所需的模板，接著內(nèi)部引物對(duì)靶基因片段進(jìn)行引導(dǎo)合成。如此循環(huán)反應(yīng)zui終形成帶有類似花椰菜的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該法可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)109—1010倍的擴(kuò)增。Malcolm等結(jié)合多重PCR技術(shù)和LAMP方法，構(gòu)建了副溶血性弧菌的定量檢測(cè)體系[9]。Lee結(jié)合LAMP和免疫層析技術(shù)，以未前處理的全血和牛奶為檢測(cè)對(duì)象，實(shí)現(xiàn)了*和大腸桿菌O157：H7的檢測(cè)[10]。LAMP方法是一種快速簡(jiǎn)便、省時(shí)省力、特異性好、靈敏的致病菌檢測(cè)技術(shù)。